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流式細(xì)胞術(shù)作為一項(xiàng)生命科學(xué)領(lǐng)域的重要技術(shù)，想要使用好自然是不容易。相信不少小伙伴在使用幾次之后，還是會(huì)有云里霧里的感覺(jué)。真正想掌握好一門(mén)技術(shù)，還是得從基礎(chǔ)部分就做好。話(huà)不多說(shuō)，直接上干貨！

1 如何搭配流式抗體熒光標(biāo)記？

流式抗體熒光標(biāo)記搭配主要由3個(gè)因素決定：流式細(xì)胞儀能檢測(cè)多少個(gè)通道、需要同時(shí)檢測(cè)多少個(gè)指標(biāo)、廠家的抗體有多少種熒光標(biāo)記。流式細(xì)胞儀的通道越多，那么同一份樣本能同時(shí)檢測(cè)的表面/胞內(nèi)/核內(nèi)蛋白就越多。

以Calibur為例說(shuō)明：Calibur的FL1通道選擇了FITC就不能選擇AlexaFluro488，或者選擇了Alexa Fluro488就不能選FITC；Calibur的FL3通道盡管能檢測(cè)PE-Texas Red, PE-Cy5, PerCP, PerCP-Cy5.5, PE-Cy7五個(gè)熒光素，但是我們搭配的時(shí)候只能選擇其中1個(gè)。

如果流式細(xì)胞儀能做4個(gè)通道，在第1個(gè)原則之下，那么每個(gè)通道隨便選出1個(gè)熒光素就可以組合成4個(gè)顏色。以2根激光的Calibur為例，如常用的搭配是FITC(FL1)＋PE（FL2）＋PerCP（FL3）+APC(FL4), 這個(gè)搭配組合可以更改成Alex Fluro488(FL1)＋PE（FL2）＋PerCP（FL3）+APC(FL4), 或者FITC(FL1)＋PE（FL2）＋PerCP（FL3）+AlexFluro647(FL4)，或者FITC(FL1)＋PE（FL2）＋PE- Cy5（FL3）+APC(FL4)等多種組合。總之，在第原則之下，我們可以隨意搭配和組合各個(gè)熒光素。但是需要注意的是，APC和PE-Cy5一起使用的話(huà)，容易導(dǎo)致補(bǔ)償度，因此，通常我們不會(huì)將這兩種熒光素一起使用，即使他們不在同一通道檢測(cè)。

流式細(xì)胞儀有哪些激光

比如，標(biāo)配的FACSCalibur只有一根488nm的激光，能做FL1、FL2、FL3三個(gè)熒光通道/三個(gè)顏色，而選配的Calibur (FACSCalibur的簡(jiǎn)稱(chēng))配有488nm和635nm兩根激光，可以檢測(cè)FL1-FL4四個(gè)通道/4個(gè)顏色。不同型號(hào)的流式細(xì)胞儀的同樣的一個(gè)通道檢測(cè)熒光素的能力不一樣比如Calibur的FL3（第3通道）能檢測(cè)PE-TexasRed, PE-Cy5, PerCP, PerCP-Cy5.5,PE-Cy7,而FACSAria的第3 通道只能檢測(cè)PE-Texas Red,PE-Cy5, PerCP。Calibur第3通道能檢測(cè)的PerCP-Cy5.5在FACSAria上是第4通道檢測(cè)。Calibur和LSR都能檢測(cè)4個(gè)顏色，但是第4個(gè)通道檢測(cè)的熒光素是不一樣的。

3 如果檢測(cè)的指標(biāo)數(shù)目超過(guò)了流式細(xì)胞儀的通道，怎么辦？

如果需要做5個(gè)指標(biāo)，而流式細(xì)胞儀只能做4個(gè)通道，首先將指標(biāo)歸成2類(lèi)，再將樣本分成2份，分別檢測(cè)。比如需要同時(shí)檢測(cè)CD3、CD4、CD8、IL-4和IFN-gamma，可以將樣本分成兩份，第1份加CD3、CD4、CD8 和IL-4，而第2份加CD3、CD4、CD8和IFN-gamma。具體的歸類(lèi)方式可根據(jù)課題的設(shè)計(jì)來(lái)進(jìn)行。

4 流式檢測(cè)樣本如何保存？

全血樣本：一般來(lái)說(shuō)，血液樣本必須在6個(gè)小時(shí)內(nèi)處理，晚不得超過(guò)12小時(shí)；做完染色后，需要放在多聚甲醛中保存，一般可以存放3天左右。培養(yǎng)細(xì)胞樣本：培養(yǎng)的細(xì)胞可以用多聚甲醛保存。做DNA倍體的樣本：將樣本保存在70%的乙醇中，并適量加入血清，-70℃冰箱保存，可以幾個(gè)月內(nèi)檢測(cè)。

5 抗體染色的細(xì)胞不能立即檢測(cè)該如何處理？

如果實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞活性要求比較高，如凋亡實(shí)驗(yàn)，必須盡快檢測(cè)；

如果實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞活性要求不高，可以使用含有4%多聚甲醛的PBS固定樣本30分鐘，固定后的細(xì)胞4℃過(guò)夜保存，次日檢測(cè)。

6 同型對(duì)照的作用是什么？

抗體有時(shí)會(huì)和非抗原結(jié)合，可能會(huì)因?yàn)榉翘禺惖牡鞍?蛋白相互作用結(jié)合細(xì)胞內(nèi)成分，因?yàn)槭杷饔媒Y(jié)合脂肪，也可能會(huì)結(jié)合一些細(xì)胞表面表達(dá)的抗體受體。比如，IgG亞型的抗體會(huì)結(jié)合細(xì)胞表面的Fc受體，如CD16、CD32和CD64。理想條件下，各種類(lèi)型的非特異性結(jié)合都可以通過(guò)蛋白（BSA、牛奶或動(dòng)物血清）來(lái)阻斷。Fc受體的結(jié)合則可以通過(guò)與含免疫球蛋白的血清預(yù)孵育來(lái)阻斷。一個(gè)抗體非特異性相互作用和受體結(jié)合的情況，可以用無(wú)關(guān)抗原的相同亞型抗體來(lái)比照。

7什么時(shí)候需要使用同型對(duì)照？

做胞內(nèi)流式實(shí)驗(yàn)：比如胞內(nèi)細(xì)胞因子、趨化因子和信號(hào)蛋白等。

表面標(biāo)志特異性不高或者不常見(jiàn)的： 一些特異性不高的抗體，如多抗，非特異性結(jié)合非常多，使用同型對(duì)照可排除假陽(yáng)性； 因?yàn)椴皇煜げ怀Ｒ?jiàn)標(biāo)志的表達(dá)情況，根據(jù)同型對(duì)照可以判斷陽(yáng)性細(xì)胞的位置。對(duì)流式非常熟悉，且檢測(cè)的是CD3、CD4、CD19等表達(dá)強(qiáng)度非常高的標(biāo)志，可以不使用同型對(duì)照。

8怎樣選擇同型對(duì)照？

一般選擇與一抗的成分相同種屬來(lái)源、相同亞型和亞鏈、相同熒光標(biāo)記的抗體：

比如抗人的CD56 FITC標(biāo)記的抗體，亞型是Mouse IgG1,κ，那么它的同型對(duì)照應(yīng)該是FITC標(biāo)記的Mouse IgG1,κ。

如果是抗體的組合形式，純化的一抗＋熒光標(biāo)記的二抗，那么應(yīng)該選擇一抗的同型對(duì)照：

比如CD86的純化抗體，亞型是Mouse IgG1,κ，二抗是PE標(biāo)記的抗小鼠IgG1，那么它的同型對(duì)照是純化的Mouse IgG1,κ。染色方式如下：樣本管，純化的CD86＋PE標(biāo)記的抗Mouse IgG1(二抗)＋樣本；同型對(duì)照管，純化的同型對(duì)照＋PE標(biāo)記的抗Mouse IgG1(二抗)＋樣本。如果沒(méi)有找到適合的同型對(duì)照，在保持來(lái)源相同、熒光標(biāo)記相同、免疫球蛋白類(lèi)別相同條件下，優(yōu)先選擇的順序是亞鏈不同--亞型不同--相同類(lèi)別,比如，某抗體的來(lái)源是Mouse IgG2а,κ。如果在同型對(duì)照表里找不到相同的同型對(duì)照，那么優(yōu)先選擇相同熒光標(biāo)記Mouse IgG2а為同型對(duì)照；如果也沒(méi)有找到Mouse IgG2а，那么優(yōu)先選擇相同熒光標(biāo)記的Mouse IgG2b作為同型對(duì)照；如果后還是沒(méi)有找到Mouse IgG2b，那么選擇相同熒光標(biāo)記的Mouse IgG2作為同型對(duì)照。

9為什么有時(shí)候同型對(duì)照的表達(dá)會(huì)比抗體的表達(dá)高？

首先需要檢查同型對(duì)照是否加錯(cuò)類(lèi)型、劑量等。其次，因?yàn)橛行?biāo)志在流式細(xì)胞術(shù)的表面或者胞內(nèi)表達(dá)不高，而跟其類(lèi)似的抗原非常多，那么加入同型對(duì)照時(shí)，同型對(duì)照非特異性的結(jié)合會(huì)超過(guò)抗體的特異性，所以會(huì)造成這種現(xiàn)象。這個(gè)時(shí)候推薦使用其他陰性對(duì)照，如空白對(duì)照等。