1.目的
掌握BCA法測(cè)定 蛋白質(zhì) 濃度的原理。
2.原理
BCA(bicinchonininc acid)與二價(jià)銅離子的硫酸銅等其他試劑組成的試劑，混合一起即成為蘋(píng)果綠，即BCA工作試劑。在堿性條件下，BCA與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，蛋白質(zhì)將Cu2+ 還原為Cu+ ，一個(gè)Cu+ 螯合二個(gè)BCA分子，工作試劑由原來(lái)的蘋(píng)果綠形成紫色復(fù)合物，*光吸收強(qiáng)度與蛋白質(zhì)濃度成正比。
3.計(jì)算
① 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
② 以測(cè)定管吸光度值，查找標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出待測(cè)血清中蛋白質(zhì)濃度(g/L)。
③ 再?gòu)臉?biāo)準(zhǔn)管中選擇一管與測(cè)定管光密度相接近者，求出待測(cè)血清中蛋白質(zhì)濃度(g/L)。
4.實(shí)驗(yàn)器材
① 7220型分光光度計(jì)
② 恒溫 水浴 箱
③ 中試管7支
④ 槍式移液管
5.試劑
①試劑A：1％BCA二鈉鹽；2％無(wú)水碳酸鈉；0.16%酒石酸鈉；0.4％氫氧化鈉；0.95％碳酸氫鈉；混合調(diào)PH值至11.25。
② 試劑B：4％硫酸銅。
③ BCA工作液：試劑A 100ml ＋ 試劑B 2ml混合
④ 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液：用結(jié)晶牛 血清 白蛋白根據(jù)其純度用生理鹽水配制成1.5mg/ml的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液。（純度可經(jīng)凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量而確定）
⑤ 待測(cè)樣品：用雙縮脲測(cè)定法的樣品稀釋而成。
6.BCA的優(yōu)缺點(diǎn)
① 操作簡(jiǎn)單，快速，45分鐘內(nèi)完成測(cè)定，比經(jīng)典的Lowary法快4倍且更加方便；
② 準(zhǔn)確靈敏，試劑穩(wěn)定性好，BCA試劑的蛋白質(zhì)測(cè)定范圍是20-200μg/ml，微量BCA測(cè)定范圍在0.5-10μg/ml。
③ 經(jīng)濟(jì)實(shí)用，除試管外，測(cè)定可在微板孔中就進(jìn)行，大大節(jié)約樣品和試劑用量；
④ 抗試劑干擾能力比較強(qiáng)，如去垢劑，尿素等均無(wú)影響
此法測(cè)定 蛋白質(zhì) 濃度，近些年被科研工作者廣泛選用?？傊m然蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法很多，但是，還沒(méi)有一個(gè)完美的方法。在選擇測(cè)定方法時(shí)，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和實(shí)驗(yàn)室條件決定。
