western blot的試驗過程及注意事項的材料
1. 把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳搬運到硝酸纖維膜上。
1）搬運緩沖液洗刷凝膠和硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，用5ml移液管在凝膠上來回翻滾去除一切的氣泡。
2）在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙（預(yù)先用搬運緩沖液浸濕），將凝膠夾在中心，堅持濕潤和沒有氣泡。
3）將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙依照廠家主張辦法放入電泳裝置中，凝膠面向陰極。
4）將上述裝置放入緩沖液槽中，并灌滿搬運緩沖液以吞沒凝膠。
5）依照廠家所示接通電源開端電泳搬運。
6）搬運完畢后，取出薄膜和凝膠，棄去凝膠。
2. 將薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量規(guī)范閃現(xiàn)時取出，記載下規(guī)范方位。
3. 用100ml水洗刷纖維素膜，必要時可用脫色緩沖液。
4. 膜置印跡緩沖液中于37℃保溫1小時。
5. 室溫下，用PBS-Tween緩沖液洗刷薄膜。
6. 用封口機將薄膜封入塑料袋中，盡可能不留空氣。
7．袋的一角剪一緩沖液的小口，用透析袋夾緊。
8．混合：NGS(100微升)，印跡緩沖液中的抗體（10毫升），加在裝薄膜的袋中，于室溫下?lián)u擺2小時（或4℃過夜）
9．用總體積300ml PBS-Tween緩沖液，分4次在一淺盤中洗刷薄膜，每次75ml。
10． 將銜接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS）加在袋內(nèi)，于室溫下?lián)u擺1小時。
11． 按過程9洗刷。
12． 參加抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS），于室溫下?lián)u擺。
注意事項：
western blot中搬運在膜上的蛋白處于變性狀況，空間結(jié)構(gòu)改動，因而那些辨認(rèn)空間表位的抗體不能用于western blot檢測。這種情況能夠?qū)⒈磉_(dá)意圖蛋白的細(xì)胞或細(xì)胞裂解液中的一切蛋白物素化，再用酶符號親和素進(jìn)行western blot。試驗中取膠和膜需帶手套。
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